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      PCR反應條件如何選擇?

      瀏覽:155 發表時間:2020-03-02 15:21:11

      在做PCR實驗時你是否也在為反應條件如何選擇而煩惱呢,該用什么溫度、反應需要的時間和循環次數。怎么選擇才不容易出錯,今天我們一起來看看吧




      溫度與時間的設置




      基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40~60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100~300bp時)可采用二溫度點法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。



      01

      變性溫度與時間




          變性溫度低,解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,93℃~94℃min足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性,就會導致PCR失敗。



      02

      退火(復性)溫度與時間



          退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發生結合。由于模板DNA比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:


      Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)

      復性溫度=Tm值-(5~10℃)

      在Tm值允許范圍內,選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合,提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30~60sec,足以使引物與模板之間完全結合。


      03

      延伸溫度與時間



      TaqDNA聚合酶的生物學活性:

      70~80℃150核苷酸/S/酶分子

      70℃60核苷酸/S/酶分子

      55℃24核苷酸/S/酶分子

      高于90℃時,DNA合成幾乎不能進行。

          PCR反應的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間,可根據待擴增片段的長度而定,一般1Kb以內的DNA片段,延伸時間1min是足夠的。3~4kb的靶序列需3~4min;擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些。



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