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      質粒提取常見問題分析

      作者:上海捷瑞生物工程有限公司 瀏覽: 發表時間:2020-02-27 00:00:00

      質粒提取常見問題分析

      一、未提出質粒或質粒得率較低:

      1.大腸桿菌老化   

        請涂布平板培養后,重新挑選新菌落進行液體培養。

      2.質粒拷貝數低   

        由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低,可更換具有相同功能的高拷貝數載體。

      3.菌體中無質粒   

        有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在,經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如,cos質粒在大腸桿菌中不能長期穩定存在,因此不要頻繁轉接,每次接種時應接種單菌落。另外,檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

      4.堿裂解不充分   

        使用過多菌體培養液,會導致菌體裂解不充分,可減少菌體用量或增加溶液I、II和III的用量。對低拷

      貝數質粒,提取時,可加倍使用溶液I、II和III,可能有助于增加質粒提取量和質粒質量。

      5.溶液使用不當  

        溶液II在溫度較低時可能出現渾濁,應置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液,才能使用。

      6.吸附柱過載  

        不同產品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的質粒量很大,請分多次提取。若用富集培養基,例如TB 或2×YT,菌液體積必須減少;若質粒或宿主菌是非常高的拷貝數或生長率,則需調整LB培養液體積。

      7.質粒未全部洗脫(尤其質粒較大時)  

        洗脫溶解質粒時,可適當加溫或延長溶解時間。

      8.乙醇殘留  

        漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體,再加入洗脫緩沖液。

      9.洗脫液加入位置不正確  

        洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。

      10.洗脫液不合適

        DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫,如洗脫緩沖液 (2.5 mM Tris-HCl, pH 8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.5-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內,如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。

      11.洗脫體積太小 

         洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高,但產品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

      12.洗脫時間過短  

         洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置一分鐘可達到較好的效果。

      二、質粒純度不高:

      1.混有蛋白  

        不要使用過多菌體。溶液I、II和III處理并離心后溶液應為澄清的,如果還混有微小蛋白懸浮物,可再次離心去除后再進行下一步驟。

      2.混有RNA 

        RNase A處理不徹底,請減少菌體用量或加入溶液III之后室溫放置一段時間。如果溶液I已保存6個月以上,請在溶液I中添加RNase A。

      3.混有基因組DNA

        加入溶液II和III后應溫和混勻,如果劇烈振蕩,可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質粒中。如果加入溶液II后過于粘稠,無法溫和混勻,請減少菌體用量。細菌培養時間過長會導致細胞和DNA的降解,不要超過16 小時。

      4.Solution III溶液加入時間過長  

        Solution III溶液加入后,放置時間不要太長,否則有可能會產生小片段DNA污染。

      5.含大量核酸酶的宿主菌  

        宿主菌含大量核酸酶,在質粒提取過程中降解質粒DNA,影響提取質粒DNA的完整性,最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌,如DH5α和Top10。

      6.裂解時間過長  

        加入溶液II后裂解時間不應超過5分鐘。菌體量合適時,裂解應該在1分鐘之內就可以完成。

      7.質粒的二聚體、多聚體及復制中間體形式  

        質粒復制過程中形成的,與宿主菌相關,電泳可檢測出。


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